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Golgi染色:原理、方法与应用

什么是Golgi染色?

Golgi染色是一种用于观察神经组织中单个神经元及其突起的组织学技术。该方法由Camillo Golgi于1873年创立,至今仍是观察神经元结构的重要手段。与标记组织切片中大多数细胞的染色方法不同,Golgi法只浸染少数神经元。这种选择性染色使研究人员能够追踪单个树突,并在染色质量允许的情况下观察树突棘等精细结构。Golgi染色已广泛应用于神经元发育、脑组织结构以及疾病相关神经元结构变化的研究。

Golgi染色是如何工作的?

Golgi染色通过浸染过程发挥作用:在浸染过程中,化合物在少数神经元内形成可见沉积。在原始Golgi法中,组织经重铬酸钾处理后再用硝酸银处理,形成铬酸银沉积。Golgi-Cox法则使用含汞和铬酸盐化合物的不同配方。为何只有部分神经元被浸染尚不完全清楚。但正是这种选择性染色使该技术独具价值:单个神经元得以清晰呈现,而不被密集染色的邻近细胞遮挡。

Golgi染色可以揭示什么?

Golgi染色使研究人员能够观察神经元形态学的几个重要特征:神经元胞体:神经元的整体形状与组织结构。树突:树突长度、分支模式与分支化程度。树突棘:棘的密度、大小与形态。轴突:在充分浸染的情况下可观察轴突结构。神经元构筑:不同脑区、实验组和发育阶段之间的结构差异。这些观察的质量与完整性取决于组织制备、染色条件和成像方法。

Golgi染色方法的类型

Golgi法自1873年问世以来经历了多次改良。尽管这些技术的目标都是显示单个神经元,但在化学配方和组织处理程序上各不相同。

经典Golgi方法

Camillo Golgi的原始技术是将神经组织用重铬酸钾处理,再用硝酸银处理。生成的铬酸银沉淀使一小部分神经元在相对清晰的背景上显现出来。

快速Golgi方法

快速Golgi法是对原始程序的早期改良。尽管名称中有"快速"二字,它与现代商品化染色试剂盒(如FD Rapid GolgiStain™试剂盒)并不相同。

Golgi-Cox方法

Golgi-Cox法使用含汞和铬酸盐化合物的混合物进行组织浸染。它仍然是研究神经元结构、特别是树突树和树突棘的常用方法。

改良Golgi-Cox方法

现代Golgi-Cox染色的改良旨在解决传统方法的局限,包括浸染不均和处理时间过长等问题。FD Rapid GolgiStain™试剂盒基于改良的Golgi-Cox法,提供标准化试剂和详细的操作流程。

Golgi-Cox染色流程:一般工作步骤

Golgi-Cox染色包括多个阶段,从组织浸染到切片与染色。尽管基本工作流程在许多方案中相似,但试剂配方、孵育时间和组织处理条件可能差异很大。以下概述以FD Rapid GolgiStain™试剂盒的操作流程为参考,描述一般工作流程,它不能替代经过验证的实验室操作规范。

1. 组织制备
组织状态是Golgi-Cox染色的重要影响因素。根据方法不同,可使用新鲜或适当固定的神经组织,但固定与保存条件会影响浸染效果。对于FD Rapid GolgiStain™试剂盒,建议使用新鲜或短暂固定的脑组织。不建议使用之前经福尔马林固定或冷冻保存的组织,已经切片的组织不适用于该试剂盒的操作流程。

2. 组织浸染
在浸染过程中,将组织浸入含汞和铬酸盐化合物的溶液中。试剂逐渐渗入组织,产生Golgi-Cox染色特有的选择性标记。这是整个流程中耗时最长的阶段之一。在FD Rapid GolgiStain™试剂盒的操作流程中,A液和B液按等体积混合,至少提前24小时配制。然后将组织浸染约两周,具体时间可根据样本调整。

3. 浸染后处理
浸染完成后,组织在切片前还需进一步处理。这一阶段为染色流程的后续步骤做好准备。在FD Rapid GolgiStain™试剂盒的操作流程中,将浸染后的组织转入C液至少72小时。根据说明书,最长可孵育约一周。

4. 组织切片 

处理完成后,将组织切片以暴露神经元结构供显微镜观察。切片厚度和切片方法取决于操作流程和实验目的。当研究目标是观察树突分支或树突棘时,在切片过程中保持组织完整性尤为重要。

5. 染色与显色

切片经过最后的染色过程,使浸染的神经元结构在光学显微镜下可见。在FD Rapid GolgiStain™试剂盒的操作流程中,将D液和E液与蒸馏水混合配制工作染色液。试剂配制和染色条件应遵循厂家说明书。

6. 显微镜观察与分析
染色封片后,可用光学显微镜观察切片。浸染良好的神经元可显示胞体、树突树和单个树突棘。研究人员可利用这些标本评估神经元形态,包括树突长度、分支复杂度和棘密度。单个神经元是否适合定量分析,取决于染色质量、组织完整性和可见神经元突起的完整程度。
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注意事项
Golgi-Cox染色需要仔细把控组织制备、试剂操作和处理时间。浸染不完全、沉淀形成或组织损伤都可能干扰神经元结构的观察。由于Golgi-Cox试剂含有有害的汞和铬酸盐化合物,必须遵守适当的实验室安全规范和化学废弃物处理规定。有关试剂配制、孵育条件和问题排查的具体细节,研究人员应查阅染色系统附带的操作流程。

Golgi染色 vs. Nissl染色

Golgi染色和Nissl染色是研究神经组织的两种经典组织学方法。虽然两者都揭示神经元结构的某些方面,但用途不同,染色图谱也截然不同。

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Golgi染色

Golgi染色只标记相对少数的神经元,常显示胞体和树突树的大部分。在合适的染色条件下,还可观察到树突棘等精细结构。由于周围神经元一般不被染色,研究人员观察单个细胞时受周围神经元突起的干扰较小。这使Golgi染色特别适用于研究树突分支、神经元形态和棘形态。

Nissl染色 

Nissl染色使用碱性染料(如甲酚紫)标记细胞内富含RNA的结构,主要是构成尼氏体的粗面内质网和核糖体。与Gogi染色不同,Nissl染色通常显示组织切片内的大量神经元胞体。常用于观察细胞构筑、确定解剖边界,,以及评估不同脑区神经元的分布与组织形式。但Nissl染色一般不能显示完整的树突树或单个树突棘。

主要区别

特征         高尔基染色         尼氏染色

 

主要染色目标     部分神经元及其突起       细胞内富含 RNA 的结构

 

染色模式       相对少量的神经元被染色     大量神经元胞体被染色

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树突可视化      可观察到广泛的树突结构     通常较为有限

 

树突棘        在适当条件下可以观察到     通常不可见

 

常见应用       神经元形态、树突分支、                细胞构筑、神经元分布、  解剖结构

组织                                树突棘分析    

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主要局限性      浸染程度不稳定及选择性标记   对神经元突起的可视化能力有限

该用哪种方法?

选择取决于研究问题。对于关注神经元构筑、树突复杂度或棘形态的研究,Golgi染色通常更有价值。它让研究人员观察单个神经元的形态,而不只是它在组织中的位置。Nissl染色更适合研究组织结构、神经元分布和解剖分区的界定,也可用于评估神经元群体的变化,但可靠的细胞计数需要恰当的取样和分析方法。两种方法常常互补而非互相替代。一项同时研究神经元组织形式和树突形态的课题,在不同组织切片上分别使用两种方法可能会获益。

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FD Cresyl Violet 溶液:用于 Nissl 染色

针对使用 Nissl 染色的科研人员,FD NeuroTechnologies 提供两款专为神经组织染色设计的 Cresyl Violet 溶液。两款产品均采用经 Biological Stain Commission 认证的醋酸甲酚紫制备,适用于观察神经元胞体和胶质细胞核。

FD Cresyl Violet Solution™ (Regular Strength, PS102-01) 专为常规 Nissl 染色设计,可将细胞核染色质和尼氏体染成紫色。

FD Cresyl Violet Solution™ (Double Strength, PS102-02) 采用更高浓度的配方,适用于 Nissl 染色,也可用于神经组织及非神经组织免疫染色切片的复染。

两款溶液均经过充分测试,并在瓶身直接印有详细的分步操作说明,方便实验室使用。

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Golgi染色的局限性

 

Golgi染色在观察神经元形态方面仍有价值,但在设计实验或解读结果时应考虑该技术的若干局限。染色差异 Golgi染色的主要挑战之一是神经元浸染的差异性。即使在同一组织样本中,有的神经元染色完整,有的只有部分标记,有的完全未染色。浸染质量可受组织状态、试剂配制、孵育时间和处理条件的影响。染色不完全可能使追踪树突分支或准确评估棘形态变得困难。

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神经元标记的选择性

Golgi染色通常只标记少数神经元。这对观察单个细胞是优势,但也限制了该技术在研究整个神经元群体方面的用途。被染色的神经元不一定是组织中所有神经元的随机样本。在选择细胞做定量分析以及解读实验组间差异时应考虑到这一点。

 

组织制备与兼容性

染色前的组织处理会显著影响最终结果。固定、冷冻、保存条件和组织损伤都可能干扰浸染,具体取决于染色方法。不同的Golgi方案对组织的要求不同。例如,FD Rapid GolgiStain™试剂盒适用于新鲜或短暂固定的脑组织。不建议使用之前经福尔马林固定或冷冻保存的组织,已切片的组织无法进行该操作流程。

 

处理时间

Golgi染色可能需要相当长的处理时间,尤其是在组织浸染阶段。尽管改良方法改善了流程的某些方面,但整个过程并不一定快速。一些Golgi-Cox方案从最初浸染到组织处理完成需要数周。研究人员在规划实验时应把这些孵育时间考虑进去,特别是在处理多个样本或时间紧迫的课题时。

 

定量分析的挑战

定量测量取决于被染色神经元的质量和完整性。浸染不完全的树突、重叠的突起、组织伪影以及棘可见度的不一致,都可能影响树突长度、分支复杂度和棘密度的测量。严格的筛选标准、一致的组织处理以及标准化的成像和分析流程,对获得可比的结果很重要。尽管有这些局限,Golgi染色仍能提供宝贵的结构信息,而这些信息用常规组织学染色很难获得。

Golgi染色在神经科学研究中的应用

Golgi染色在神经科学研究中的应用已超过一个世纪。它显示单个神经元结构的能力,使其特别适用于研究神经元形态在不同脑区、发育阶段和实验条件下的差异。

神经元形态与树突构筑
Golgi染色最经典的应用之一是观察神经元形态。研究人员可以研究单个神经元的形状与组织形式,包括树突长度、分支模式和树突分支化的范围。这些测量常用于研究不同神经元群体之间的结构差异,或评估实验处理后的形态变化。Golgi染色的神经元还可用Sholl分析等技术进行分析,通过测量距胞体不同距离处的树突交叉点数量来表征树突复杂度。
 
树突棘分析
树突棘是神经元树突上的微小突起,是哺乳动物脑中许多兴奋性突触的突触后位点。在合适的染色和成像条件下,Golgi标本使研究人员能够观察棘密度和形态。常用测量指标包括单位树突长度上的棘数量以及不同棘形态的分布。棘密度或形态的变化可能与突触连接和可塑性的改变相关。但仅凭棘的外观不能确定突触功能,形态学发现通常需要结合其他实验测量来解读。
 
神经发育研究
在神经系统发育过程中,随着树突生长、分支并建立连接,神经元经历显著的结构变化。Golgi染色曾用于观察不同发育阶段的这些过程,包括树突分支化和棘形成的变化。通过比较不同年龄组或实验条件下的神经元形态,研究人员可以探讨遗传因素、环境暴露或发育干扰如何影响神经元结构。
 
神经退行性疾病与神经系统疾病
已有研究报告神经系统疾病和神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病和帕金森病)中神经元形态的改变。Golgi染色可用于观察实验模型中的结构变化,如树突回缩、分支复杂度降低和棘密度差异。这些观察有助于理解与疾病相关的神经元结构改变。但仅凭Golgi染色无法阐明潜在的分子机制,也无法判断形态变化是疾病进展的原因还是结果。
 
神经可塑性与实验干预
神经元结构并非终身不变。树突分支和树突棘可随经验、损伤、环境条件和实验干预而发生变化。Golgi染色常用于评估学习记忆、慢性应激、脑损伤和药物处理等研究中的这些结构反应。例如,研究人员可比较给药组和对照组动物的树突分支或棘密度,以探讨某种干预是否与神经元形态变化相关。由于Golgi染色提供的是结构而非直接的功能测量,这类发现最好在适当时结合行为学、电生理或分子数据来解读。
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用FD Rapid GolgiStain™试剂盒实现现代Golgi-Cox染色

传统Golgi-Cox染色难以稳定操作,特别是当实验室自行配制试剂,或处理的组织样本在大小和状态上存在差异时。浸染和组织处理的变化会影响神经元结构的可见度和最终标本的质量。

FD Rapid GolgiStain™试剂盒是FD NeuroTechnologies开发的改良Golgi-Cox染色系统。基于Ramón-Moliner(1970)以及Glaser和Van der Loos(1981)描述的改良方法,该试剂盒提供标准化试剂和详细的操作流程,用于观察脑组织中的神经元形态。​​​​​​​​​​​​​​

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在神经元形态研究中的应用

FD Rapid GolgiStain™试剂盒用于显示神经元胞体、树突树和树突棘,可用于树突分支、神经元构筑以及棘密度或形态的研究。该方法已应用于动物脑组织和人死后脑标本。与其他Golgi类方法一样,在选择神经元进行分析时,浸染质量和神经元标记的完整性是重要的考量因素。

 

组织要求与处理注意事项

该试剂盒适用于新鲜或短暂固定的脑组织。不建议使用之前经福尔马林固定或冷冻保存的组织,已切片的组织无法使用该试剂盒的操作流程进行处理。虽然产品名为Rapid GolgiStain™,但组织浸染仍需较长的孵育时间。标准流程包括约两周的浸染,随后是组织处理、切片和染色。研究人员在开始实验前应查阅产品手册,确认组织兼容性、试剂配制和处理要求。

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研究应用与发表文献

FD NeuroTechnologies为神经科学研究供应产品已有30年。FD Rapid GolgiStain™试剂盒已被1,500多篇科学论文引用,涵盖广泛的神经科学研究应用。对试剂盒规格、现有规格和订购信息感兴趣的研究人员,可访问产品页面:FD Rapid GolgiStain™试剂盒(大包装)

关于Golgi染色的常见问题

Golgi染色是做什么用的?
Golgi染色主要用于观察单个神经元的形态。研究人员可借此研究神经元胞体、树突分支模式,在条件合适时还可观察树突棘。该技术广泛用于神经元发育、神经可塑性以及神经系统疾病相关结构变化的研究。为什么Golgi染色只标记少数神经元?Golgi染色通常只浸染组织样本中的一小部分神经元。这种选择性浸染的确切机制尚未完全阐明。这一特性是该方法的主要优势之一。由于周围大多数神经元不被染色,研究人员可以追踪单个树突树,而不受邻近细胞的严重重叠干扰。
 
Golgi染色和Golgi-Cox染色有什么区别?
Golgi染色是指源自Camillo Golgi原始方法的一类组织学技术。经典方法用铬酸盐处理后再用硝酸银,使选定的神经元内形成铬酸银沉淀。Golgi-Cox法使用不同的浸染配方,含汞和铬酸盐化合物。两种方法都能显示神经元形态,但在试剂组成和组织处理程序上有所不同。
 
Golgi染色需要多长时间?
所需时间取决于染色方法、组织特性和实验室操作流程。传统和改良的Golgi-Cox流程可能需要数周,其中组织浸染占了大部分处理时间。例如,FD Rapid GolgiStain™试剂盒的操作流程一般需要约两周的组织浸染,随后是切片染色前的进一步处理。Golgi染色能用来观察树突棘吗?能。在神经元浸染充分且成像条件合适的情况下,Golgi染色可显示神经元突起上的树突棘。研究人员常用Golgi染色标本测量棘密度并研究棘形态的差异。但染色不完全、结构重叠和成像条件的限制可能影响这些测量的可靠性。
 

为什么组织切片在 Golgi 染色过程中会从载玻片上脱落?

在 Golgi 染色过程中,组织切片可能由于附着力不足、干燥不充分或操作过于频繁而从载玻片上脱落。较厚的组织切片在整个染色过程中尤其容易出现附着困难的问题。

使用明胶包被载玻片、在染色前让切片充分干燥,以及在更换染色液时轻柔操作,都有助于减少切片脱落。

FD NeuroTechnologies 提供两款广受欢迎的明胶包被载玻片,有助于改善组织切片的附着效果。
 

FD Gelatin-Coated Microscope Slides (25 mm × 75 mm, PO101) 为标准尺寸载玻片,适用于常规组织切片的贴片操作。

FD Gelatin-Coated Microscope Slides (50 mm × 75 mm, PO105) 提供更大的载片面积,适用于需要更多空间的较大组织切片。
 

这两款产品均是我们最畅销的实验室耗材之一,采用预清洁玻璃载玻片并覆有明胶涂层,有助于提高组织切片的附着力。


 
Golgi染色在现代神经科学研究中还在用吗?

在用。尽管荧光显微镜、基因标记和其他成像技术不断发展,Golgi染色在观察神经元结构方面仍有价值,在树突构筑和棘形态的研究中尤其有用。该方法常与分子、电生理或其他成像手段联用,为神经元结构与功能提供互补信息。

参考文献

  1. Pannese E. The Golgi stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 1999;8(2):132–140.

  2. Ramón-Moliner E. The Golgi-Cox technique. In: Nauta WJH, Ebbesson SOE, editors. Contemporary Research Methods in Neuroanatomy. Springer; 1970.

  3. Glaser EM, Van der Loos H. Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 1981;4(2):117–125.

  4. Du F. Golgi-Cox staining of neuronal dendrites and dendritic spines with the FD Rapid GolgiStain™ Kit . Current Protocols in Neuroscience. 2019;88(1). https://doi.org/10.1002/cpns.69

  5. FD NeuroTechnologies, Inc. FD Rapid GolgiStain™ Kit User Manual (PK401/PK401A). Version 2019-01.

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